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    公开号:WO1990010708A1
    申请号:PCT/JP1990/000304
    申请日:1990-03-08
    公开日:1990-09-20
    发明作者:Michinao Mizugaki；Kunihiko Itoh；Nakao Ishida
    申请人:The Sendai Institute Of Microbiology；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    [0001] 明 細
    [0002] 発明の名称
    [0003] モノ ク n—ナル抗体、 それを用いた測定法、 試薬キッ ト、 検索法及び薬剤ミ サイル
    [0004] 技術分野
    [0005] 本発明はモノ ク ϋーナル抗体に関し、 さ らに詳細には、 癌 患者体液中に増加する 5—メチルシチジン （ 5 -raethylcyti dine) 等の修飾核酸塩基類に対するモノ ク o—ナル抗体に関 する。
    [0006] また本発明は、 かかるモノ ク D —ナル抗体を産生するハイ ブリ ドーマ、 モノ クロ ーナル抗体を用いた免疫測定方法、 試 薬キッ ト、 免疫組織化学的検索方法、 及び薬剤ミサィ ルに闋 する。
    [0007] 背景技術
    [0008] 癌の診断や術後のモニタ リ ングにおいて、 患者の血清中や 尿中に増加する癌関連物質いわゆる腫瘍マーカ一の測定は欠 かせぬものとなっている。 現在、 測定されている腫瘍マーカ 一としては、 癌胎児性抗原 （CEA) 、 免疫抑制酸性蛋白 ( I AP) や、 肝癌に特異的なな フュ トプロテイ ン （AF P) あるいは脖癌に特異的な糖鎖抗原の一種である C A 1 9 - 9 などがあげられる。 ところで、 癌患者の尿中に各種の修飾核 酸塩基類が増加することは、 古くから知られていた。
    [0009] 本発明者らは、 修飾核酸塩基類の腫瘍マーカーとしての有 用性を検討するため、 癌患者や、 担癌動物の尿、 血清などを 従来法である髙速液体ク πマ トグラフィ ー （HP LC') で測 定した。 その結果、 痛患者や担癌動物で 5—メチルシチジン の異常な増加が認められた。
    [0010] このように、 この化合物の腫瘍マーカーとしての有用性は 確認できたが、 H P L C分析では試料の前処理が煩雑であり 多検体の測定に非常に長い時間を要するという欠点があった c また、 5—メチルシチジンの細胞内局在および、 細胞レベル での増加の有無について免疫組織化学的に検索することは不 可能であった。
    [0011] 本発明者らは、 5 —メチルシチジン等の簡便な測定法を開 発すべく、 種々検討をおこなった結果、 5 —メチルシチジン 等に对するモノ ク ーナル抗体を新たに作製し、 これを用い ることにより、 サンプルの前処理操作を行うことなく酵素免 疫測定法を応用した多検体同時測定法を実施することができ. 測定の迅速化、 簡素化がはかれることを見出し、 本発明に到 達した。
    [0012] 発明の開示
    [0013] 本発明は低級アルキルシチジンを認識し得るモノ クローナ ル抗体、 当該モノ ク D —ナル抗体を産生するハイ プリ ドーマ に係るものである。
    [0014] また本発明は、 免疫学的方法による被検体中の低級アルキ ルシチジンを測定する方法において、 低級アルキルシチジン を認識し得るモノ クローナル抗俅を用いることを特徵とする 測定法 ； 免疫学的方法により被検体中の低級アルキルシチジ ンを測定するための試薬キッ トであって、 低級アルキルシチ ジンを認識し得るモノ ク ーナル抗体と、 低級アルキルシチ ジンとキヤ リ 了 ♦ プ ティ ン一 πとの結合物を用いたことを 特徴とする試薬キッ ト.；及び腫瘍組織中において異常代謝亢 進の結果蓄積された修飾核酸塩基類の存在を免疫組織化学的 に検索する方法において、 該修飾核酸塩基類を認識し得るモ ノ ク ーナル抗体を免疫反応により組織の一部に結合せしめ ることを特徴とする検索法に係るものである。
    [0015] さ らに本発明は当該修飾核酸塩基類を認識し得るモノ ク口 ーナル抗体を抗痛剤又は制癌剤のキヤ リ 了一として用いたこ とを特徴とする薬剤ミサイルに係るものである。
    [0016] 図面の簡単な説明
    [0017] 第 1図は、 本発明のモノ ク π—ナル抗体の 1例である M C T— 3 についての 5 —メチルシチジンの検出特性を示したも のである。 第 2図は、 本発明におけるモノ ク 口ーナル抗体の 抗体価を求める際に希釈倍率と吸光度の関係を模式的に示し たものである。 第 3図は食道癌組織を抗 1 一メチルアデノ シ ンモノ クローナル抗体で免疫染色した結果を示し、 第 4図は 食道癌組織を抗シユードウ リ ジンモノ ク π—ナル抗体で免疫 染色した結果を示し、 第 5図は正常食道組織を抗 1 一メチル 了デノ シンモノ ク ローナル抗体で免疫染色した結果を示す図 面 （写真） である。
    [0018] 発明を実施するための最良の形態
    [0019] 本発明のモノ クローナル抗体は低級アルキルシチジンを特 異的に認識する抗体である。 ここで低級アルキルシチジンと しては、 シチジンにおける氷素原子が、 メチル基、 ェチル基. プロ ピル基、 イ ソプロ ピル基、 ブチル基、 ィ ソブチル基、 ぺ ンチル基、 ィ ソペンチル基等の直鎖状又は分岐妆の炭素原子 数が 1〜 5の低級アルキル基で置換されたものがあげられる かかる低級アルキル基のうちでも、 メチル基が特に有利に用 いられるものとしてあげられる。 また低級アルキル基の導入 位置の好ましいものとしては、 シチジンを構成するビリ ミ ジ ン骨格の 3位、 5位及び 6位の少なく とも 1 ケ所があげられ, 特に 5位が有利である。
    [0020] 本発明におけるモノ クローナル抗体の中で、 腫瘍マーカ一 としての修飾核酸塩基の測定精度や安全性等の点で特に好ま しいものは、 5—メチルシチジンを認識する抗体である。 かかるモノ ク ローナル抗体のク ラスとしては、 I gGが好ま しく、 中でも I gG !や I gG2aが有利であり、 特に I gG !のク ラス のモノ ク 口ーナル抗体が 5—メチルシチジンの認識における 反応特異性が髙くかつ抗体価が高いことから実用上有利であ
    [0021] Ο 0
    [0022] また本発明のモノ ク D—ナル抗体は、 低級了ルキルシチジ ンを認識することができるものであるが、 かかる低級アルキ ルシチジンが動物の尿や血液、 リ ンパ液等の体液中にある場 合にも認識できるものであることが好ましく、 特にヒ トの体 液中の低級アルキルシチジンを認識できるものが実用上好適 ある ο
    [0023] 本発明の低級了ルキルシチジンを認識し得るモノ ク ーナ ル抗体の製造法の好ましい例として、 次の如く 5 —メチルシ チジンを認識し得るモノ クローナル抗体を調製する方法があ げられる。
    [0024] すなわち、 まず、 5 —メチルシチジンを用いて動物を免疫 し、 その動物の脾細胞を採取する。 この工程において、 5— メチルシチジンはそれ単独では免疫原となり得ないので、 適 当なキャ リ ア ' プロテイ ン（Carr i er Prote i n) ― I と結合さ せたのち、 免疫原として用いる。
    [0025] 5 ーメ チルシチジンとしては、 癌患者尿中から単離 ·精製 したもの、 合成したもの、 あるいは市販されている標準品等 を用いることができる。 キャ リ ア ' プ ティ ン一 I としては、 ハプテンとなる物質を免疫担当細胞が認識することを可能に する目的に用いられるプロテイ ン、 例えばキーホール ' リ ン ぺ ッ ト ' へモシァニン、 牛血清了ルブミ ン、 ヒ ト血清了ルブ ミ ン、 卵白アルブミ ン等を用いることができる。 また、 この 5 —メ チルシチジンとキヤ リ 了 · プロティ ン一 Iを結合する 方法としては、 例えば核酸塩基の糖部分を過ヨウ素酸で酸化 したのちにキヤ リ ア · プロティ ンー I と結合させる等の方法 が挙げられる。
    [0026] この様にして得られた 5 —メ チルシチジンとキヤ リ 了 · プ 口ティ ン一 I との結合物を用いて免疫する動物としては、 マ ウス、 ラ ッ ト等が挙げられ、 特にマウスが実用上有利に用い られる。
    [0027] 次に得られた免疫動物の脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、 ハ イ ブリ ドーマを得る。 細胞融合においては、 公知のポ リ ェチ レングリ コールを用いる方法 （ Marc Shulman, C. D. Wide & G. Kohler, Nature 276, 269-270 (1978) ) Sendai Virus により融合する方法 （G. Kohler & C. Milstein, Nature 256, 495-497 (1975) 又は Bur. J. Immunol. 6, 511-519 (1976)) 、 あるいは電気パルスによる方法 U. Vienken & U. Zimmermann, FEBS Letters 137^ 11-13 (1982)) のいずれを用いても良い ( 尚、 ハイプリ ドーマのスク リ ーニングに当たっては、 キヤ リ 了 · プロティ ンに対する抗体産生ハイ ブリ ドーマを除去する ための工夫が必要である。 このためには、 免疫に用いたキヤ リ了 · プ ティ ンー I と異なった種由来のプ ティ ンを 5— メチルシチジンに結合させたものを抗原として用い、 抗体産 生ハイ プリ ドーマのスク リ一二ングを行う等の方法を用いる ことが望ましい。
    [0028] この様にハイ プリ ドーマを経由して本発明のモノ ク ーナ ル抗体を製造する際の、 脾細胞と ミ ヱローマ細胞は、 同一種 の動物からのものが好ましく、 特にマウス脾細胞とマウス由 来ミエ 一マ細胞が実用上に好適である。
    [0029] 次に、 本発明においては、 選択したハイ ブリ ドーマ又は形 質転換細胞を培養して、 所望の特異的モノ ク n —ナル抗体を 生成させる。 クローニングによって選択された、 低級了ルキ ルシチジンを認識する抗体を産生するハイ ブリ ドーマ又は形 質転換細胞は凍結して保存することができ、 また、 これを適 当な方法で大量に培養することもできる。 そして、 培養上清 から低級アルキルシチジンに特異的に結合するモノ クローナ ル抗体を得ることができる。 また、 かかる細胞を動物に移植 して腫瘍化し、 その腹水や血清から目的とする抗体を得るこ ともできる。 本発明のモノ クローナル抗体の精製は、 ァフィ 二ティ クロマ トグラフィー等の方法によって行なわれる。 また本発明には、 低級アルキルシチジンとキヤ リ了 · プロ ティ ン一 I との結合体を免疫原として用いて得られた低級了 ルキルシチジンを認識し得る抗体の産生能を有する脾細胞と. ミエローマ細胞とを融合して得られるハイ プリ ドーマも含ま れる。 かかるハイ プリ ドーマを得る方法としては、 前記のモ ノ クローナル抗体の製造法におけるハイ ブリ ドーマの調製法 が好適である。
    [0030] 本発明者らは、 かかる低級アルキルシチジンを認識し得る モノ ク ーナル抗体によって、 進行癌のマーカ一として患者 の尿、 血清等に体液中の低級アルキルシチジン、 特に好適に は 5 ーメチルシチジンを簡単に精度よく測定し得ることを見 い出し、 本発明の測定法に到達した。
    [0031] 即ち本発明の測定法は、 免疫学的方法により被検体中の低 級アルキルシチジンを測定する方法において、 低級アルキル シチジンを認識し得るモノ ク ローナル抗体を用いることを特 徴とするものである。 ここで被検体 （以下試料ともいう） の 好ま しいものとしては、 前記の如く動物、 特にヒ トの体液自 体、 又は処理を施したものがあげられるが、 体液自体を用い る方法が簡便であり有利である。
    [0032] 本発明の測定法においては、 低級アルキルシチジンを認識 し得るモノ ク π—ナル抗体を担体に固定化しておくのが好ま しいが、 固定化の方法は公知の方法を採用でき、 担体として は固相の、 例えば、 ポ リ スチレン、 ポ リ エチレン、 ポ リアク リ レー ト、 テフロ ン、 ポ リ 了セタ一ル等を用いた、 ボール、 ビーズ、 ギヤ、 マイ クロプレー ト等が好ましく使用される。 また、 モノ ク σ—ナル抗体の標識化の方法や手段、 それの 検出方法や手段は何ら限定されるものではなく、 公知の方法 や手段、 例えば、 放射性物質又は酵素若しく は蛍光物質で標 識された抗免疫グ πブリ ン抗体またはブドウ球菌蛋白 Αとの 2次反応により測定することができる。 標識剤としては、 酵 素を用いる方法 （E I A ) ではホースラディ ッ シュパーォキ シダ一ゼ、 /9一 D—ガラク ト シダーゼ、 アルカ リ フォスフ ァ ターゼ等の酵素が ；放射性物質を用いる方法 （R I A) では 125 I , 3H等が ；蛍光物質を用いる方法 （F I A) ではフ ルォレセィ ンィ ソチォサイ 了ネー ト等が通常使用されるが、 その標識剤の活性が測定可能であれば、 その他のものであつ てもよい。
    [0033] 標識剤が酵素である場合には、 その活性を測定するために 基質が用いられる。 基質としては例えば、 ホースラディ ッ シ ュパーォキシダーゼの基質として、 2， 2' —アジノ ジ一 [ 3 一ェチルベンズチ了ゾリ ンスルホン酸] アンモニゥ厶酸 （A B T S ) — H 2〇2 、 5—了 ミ ノサ リチル酸一 H2〇 2 、 0— フエ二レンジ了ミ ン一 H202 、 4 一ア ミ ノ ア ンチ ピ リ ン 一 H2〇 2 などを、 β— Ώ一ガラ ク ト シダーゼの基質として、 フルォレセイ ンージー （ 一 D—ガラク ト ビラノ シ ド） 、 0 一二ト ロフエノ ールー 一 D—ガラク ト ピラノ シ ドなどを挙 げることが出来る。 測定のためには、 これらの試薬以外にも 溶解剤、 洗净剤、 反応停止剤等の公知の試薬が使用される。 また抗原一抗体複合体の偏光を利用する方法も考えられる。 本発明の免疫測定法の実施態様として、 5—メチルシチジ ンの定量を行う場合について以下の如く例示する。
    [0034] すなわち、 9 6 ゥュルマイ ク πプレー トに、 5 —メチルシ チジンと牛血清アルブミ ン （B S A) の結合物を 1 gZゥ エルで添加したのち 4でで、 1 2〜 2 4時間放置する。 次に 各ゥエルに 1 %B S Aを含むリ ン酸緩衝生理食塩液 （P B S) を 1001 ^ずつ添加することにより、 抗体その他のタンパク の非特異的吸着を防止する。 次に試料 （尿および血清など） を各ゥエルに 5 0 M i添加する。 よく攪拌したのちに、 4 で 1時間放置する。 各ゥ ヱルを P B Sでよく洗浄したのちに、 アルカ リ ホスフ ァターゼ標識ャギ抗マゥス I gG抗体の 3000倍 希釈波を各ゥ ュルに 1 0 0 Λί ^ずつ添加する。 4 でで 4 5 分間反応させたのちに、 P B Sでよく洗い、 水分をきつたの ちに基質溶液 （パラニ トロフヱニルフォスフヱー トを 1 mg Z の濃度で 1 Mジエタノ ールアミ ンバッ フ ァ一 （P H 9. 8 ) に とかしたもの） を 1 0 0 ί ·βずつ加え 3 7 でで 3 0分間反応 させる。 各ゥヱルの 4 0 5 ntnにおける吸光度を E I Α リ ーダ 一で測定することにより試料中に存在する 5 —メチルシチジ ンの定量を行う。
    [0035] 本発明には、 また免疫学的方法により被検体中の低級了ル キルシチジンを測定するための試薬キッ トであって、 低級ァ ルキルシチジンを認識し得るモノ クローナル抗体と、 低級ァ ルキルシチジンとキヤ リ了 · プ Ό亍ィ ンー Πとの結合物を用 いたことを特徵とする試薬キッ ト も、 その範囲に含むもので ある。
    [0036] かかるモノ クローナル抗体とは前記した如き特性を有する ものである。 また、 低級アルキルシチジンと結合物をつく る キヤ リ 了 ' プ ティ ンー Πとしては、 前記したキヤ リ ア ' プ 口ティ ン一 I に関するプロティ ン群と同様の群から選ばれる ものであって、 その結合物としての抗原性がキャ リ 了 · プロ ティ ンー I と異なるものでなければならない。
    [0037] また本発明の試薬キッ トには、 モノ ク ローナル抗体と結合 物の他に、 必要に応じて標識剤や、 標識化抗体の検出試薬を 舍んでもよい。
    [0038] さらに、 本発明には、 腫瘍組織中において異常代謝亢進の 結果蓄積された修飾核酸塩基類の存在を免疫組織化学的に検 索する方法において、 該修飾核酸塩基類を認識し得るモノ ク ロ ーナル抗体を免疫反応により組織の一部に結合せしめるこ とを特徵とする検索方法も含まれる。
    [0039] かかる免疫組織化学的検索方法における組織とは、 動物、 特に実用上好適にはヒ トの細胞又は組織切片を意昧する。 本発明の検索法に用いられるモノ ク ロ一ナル抗体と して は、 前述の低級アルキルシチジンを認識し得るモノ クロ一ナ ル抗体のみならず、 抗シユ ードウ リ ジンモノ クローナル抗体 (特開昭 62-299765 号公報、 特開昭 63-222699 号公報） 、 抗 1 一メ チルアデノ シ ンモノ ク π —ナル抗体 （特開昭 6 2 - 299766号公報） などの癌関連修飾核酸塩基類に射するモノ ク αーナル抗体が挙げられる。
    [0040] 本発明の検索法は、 さらに具体的には、 組織に前記の修飾 核酸塩基類を認識し得るモノ ク π—ナル抗体を作用させるこ とにより免疫反応を生じさせて組織における当該修飾核酸塩 基類の存在部位にそのモノ ク ーナル抗体を結合せしめるこ とを特徴としている。 さらにその後、 例えばかかるモノ ク ーナル抗体を認識するピオチン化抗体で処理し、 さ らに酵素 標識アビジンを作用させる等の方法によって組織における当 該修飾核酸塩基類の存在部位を染色等で標識化せしめて進行 癌等の存在部位の検索を可能にするものである。
    [0041] この様な本発明の検索法の実施態様例として以下の方法が あげられる。 即ち本発明の免疫組織化学的検索法においては 細胞または組織切片を了セ ト ン、 ホルマ リ ン、 パラホルム了 ルデヒ ドなどで固定したのち、 1 % B S Αを含む P B Sでタ ンパク質の非特異的吸着を防ぐ。 次に、 モノ ク ローナル抗体 を反応させ、 室温 3 G分放置する。 P B Sでよく洗ったのち ピオチン化抗マウス IgG抗体を反応させ室温 3 G分放置す る。 P B Sでよ く洗ったのち、 アビジン一ピオチン化ペルォ キシターゼ複合体 （ABC) 溶液を反応させ室温で 3 0分間 放置後 P B Sでよく洗浄する。 次に、 基質溶液 （ジ了ミ ノぺ ンチジンを 0.5 mg/m£、 過酸化水素水を 0.0 1 %の濃度で含 む P B S (pH7.4 ) ) を添加し、 発色させる。 目的とする修 飾核酸塩基類の細胞内局在等を光学顕微鏡を用いて検討する。
    [0042] さ らに本発明には、 腫瘍組織中において異常代謝亢進の結 果蓄積された修飾核酸塩基類を認識し得るモノ ク D—ナル抗 体を抗癌剤又は制癌剤のキヤ リ 了一として用いたことを特徵 とする薬剤ミサイルも含まれる。
    [0043] かかる抗癌剤や制癌剤には、 例えば、 アルキル化剤として クロラムプチル、 ACNU、 C CNU、 シスブラチン等、 代 謝拮抗剤として MTX、 5 F U、 FUDR、 ARA— C等、 ビン力アル力 イ ドとしてはビンブラスチン、 ビンク リ スチ ン等、 抗生剤として MMC：、 アド リ アマイ シン、 ダウノマイ シン等が用いられるが、 いずれもこれらのモノ ク口一ナル抗 体をキヤ リ 了一として用いることが出来るものであればよく， これらに限定されるものではない。
    [0044] またこれらのモノ ク ローナル抗体をキャ リ ァ一として用い る形態としてはいかなるものであってもよく、 例えば放射性 アイ ソ トープのキャ リ アーとして用いた治療法も含まれる。 かかる放射性アイ ソ トープには、 ェ ミ ッタ一である 212 B i. 211A t等、 エ ミ ッターである 131 I、 S。Y等が用いられる, かかる本発明の薬剤ミサイルによれば、 抗癌剤や制癌剤を 患部に有効に到達させることが可能であり、 髙ぃ治療効果が 得られ且つ副作用を低下させることができる。
    [0045] また本発明には、 放射性物質、 常磁性物質、 蛍光物質等の 標識となり得る物で標識化された、 低級了ルキルシチジンを 認識し得るィメ一ジング診断用モノ ク 一ナル抗体も含まれ る 0
    [0046] ここで言う放射性物質としては例えば 1 2 5 1、 1 1 1 I n 9 9 mT c等があげられ、 常磁性物質としては例えばガド リ二 ゥム （G d ) 等があげられる。 これらはいずれも、 本発明の モノ ク ローナル抗体を標識化したものを動物、 特に好適には ヒ 卜の体内に注入し、 体内における低級了ルキルシチジンの 存在部位に到達せしめて、 その部位を標識化して、 放射線や 超音波診断でのィメ一ジング診断用に用いることができるも のであれば、 いかなるものであってもよい。
    [0047] かかる本発明のィメ一ジング診断用のモノ ク ローナル抗体 によれば、 体内で低級アルキルシチジンの発生をともなう進 行癌等の有無やその場所及びその進行度を極めて容易に診断 することが可能である。
    [0048] 尚、 本発明でモノ ク ローナル抗体の特性を表示するために 用いる抗体価とは、 例えば 5 —メチルシチジンの場合に、 5 ーメチルシチジンと牛血清アルブミ ン （B S A ) の結合物を あらかじめ 9 6 ウェルマイ ク口プレー トに吸着させておき、 そこへ本発明のモノ ク π—ナル抗体を産生するハイ プリ ドー マの培養上清液を順次 2倍希釈した液を各々加えて、 免疫反 応させた後、 各々の吸光度を測定し、 最大の吸光度が維持さ れる最大の希釈倍率を意味する。 かかる希釈倍率と得られる 吸光度の関係のバタ一ンと抗体価を模式的に示したのが第 2 図である。
    [0049] 実施例
    [0050] 次に実施例を挙げ、 本発明を説明するが本実施例に限定さ れるものではない。
    [0051] 実施例 1
    [0052] (1) 免疫原の調製 ：
    [0053] シグマ（Sigma) 社より購入した 5 —メチルシチジンと、 キ ャ リ ア · プ πティ ン一 Iであるキーホール ' リ ンぺッ ト ' へ モシ了ニンとの結合体をエルラ ンガー（Erl anger)とビーザ一 (Bieser)の方法（Pro. N. A. S. , 52 , 68 (1964)) で作製した c すなわち 5 —メチルシチジンを過ヨウ素酸で酸化し、 過剰の 過ヨウ素酸をエチレングリ コールで分解したのち、 了ルカ リ 性 （PH9〜9. 5 ) 条件下でへモシ了ニンと反応させる。 つい で水素化ホウ素ナ ト リ ゥムで還元し、 安定化合物を生成させ る。 この反応混合物を P B S (PH7.4)中で一晩透析し、 未反 応の 5 —メチルシチジンを除き、 凍結乾燥に付したのち、 一 2 0 での冷凍庫中に保存した。
    [0054] (2) モノ ク ローナル抗体の作製 ：
    [0055] ( i ) (1)で得た 5 —メチルシチジンとへモシァニン結合物 を、 フロイ ン トの完全ァジュバン ト （Freund， s Complete Adjuvant) と等量混合し、 ェマルジヨ ンとしたのち、 B A L BZ cマウスの腹腔内に一匹あたり 5 0 g投与した。 2回 目以降は不完全アジュバン ト （Incomplete Adjuvant)を用い たェマルジヨ ンを、 マウス一匹あたり 5 O ju g、 1 4 日間隔 で 2回腹腔内に投与した。 最終免疫は 5—メチルシチジン一 へモシ了ニン結合物 100 g / m£溶液を 0.2 m£静脈内投与し 0
    [0056] ( ii ) 最終免疫の 3日後に過免疫マウスから摘出した脾細胞 と BALBZ cマウス由来ミエローマ細胞祙 SP2Z0— Agl4 をポ リ エチ レ ング リ コ ール 4000を用いて融合した。 細胞 は 9 6ゥ ュルマイ ク cプレー トに 1 0 0 ju _gZゥ ェルずつ加 え、 2 4時間後に培地の半量をハツ ト （HAT) 培地に交換 し 2 日おきに培地交換した。 7〜 1 0 日後にハッ ト耐性のハ イブリ ドーマの成長がみられてく る。 この時期に培地を HT培 地に変え、 約 1 0日間培養したのちにハイ ブリ ドーマ生育培 地に変えた。
    [0057] (iii) 抗体産生細胞のスク リーニングは 5—メチルシチジン と牛血清アルブミ ン （B S A) を結合させたものを抗原とし て用いた 2抗体ェライザ （E L I S A) 法により行った。 こ の方法により最も憂慮されるキヤ リア ♦ プロテイ ンに对する 抗体を産生するハイプリ ドーマの除外に成功した。 次に 5— メチルシチジンによる阻害がかかるか否かを検討することに より 5—メチルシチジンと特異的に反応するモノ ク ーナル 抗体を産生するハイプリ ドーマを選択した。 ここで選択され たハイプリ ドーマは限界希釈法によりクローン化しモノ クロ ーナル抗体産生ハイ プリ ドーマクローンを樹立した。 その一 例であるハイ ブリ ドーマ MCT— 3は工業技術院微生物工業 技術研究所に FERM BP— 2 7 8 8として寄託した。
    [0058] (3) モノ ク n—ナル抗体の性質 ：
    [0059] 得られたモノ ク ローナル抗体は、 その反応特異性の相違か ら 3つのグループに分類した。 すなわち、 （ i ) 5—メチル シチジンとのみ非常に強く反応するモノ ク口ーナル抗体 （M C T— 3他 4 ク ローン） （ ii ) 5 —メチルシチジンとの反応 は （ i ) に示すモノ ク口ーナル抗体より も弱いながらも、 他 の核酸塩基とは反応しないモノ ク ローナル抗体 （MC T— 6 他 1 ク ーン） （iii) 5 —メチルシチジン、 5 —メチルシ ト シン、 さ らには、 チ ミ ジン、 シチジンと反応するモノ ク ー ナル抗体 （MC T— 8他 1 ク ローン） である。 各グループで. 最も反応性の高かったモノ ク ローナル抗体、 即ち MC T— 3. MC T— 6および MC T— 8についての抗体価及び反応特異 性を示すと第 1表の如くなる。
    [0060] 第 1 表
    [0061]
    [0062] * ) +++…反応性が髙ぃ
    [0063] ++ …反応性が中程度
    [0064] + …反応性が低い
    [0065] 一 …反応性がない
    [0066] 実施例 2
    [0067] 5 —メチルシチジン一 B S A (0. l ju gノウ ヱル） でコ一 ト した 9 6 ウ ェルマイ ク 1 αプレー ト に 5 —メ チルシチジンの 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、 10- 10_7M溶液を各 5 0 ず つ加えたのちに、 MC T— 3モノ クローナル抗体の 3 0倍希 釈液を 5 0 β ·δずつ加え、 競合実験を行った。 その結果、 第 1図に示すごとく、 添加した 5—メチルシチジンの量に比例 して、 MC Τ— 3抗体と 5 —メチルシチジン一B S Αの結合 が阻害されることが明らかとなった。 この反応曲線を検量線 とした時、 5—メチルシチジンの検出跟界は 1 ρηιο·βであり、 この測定系を用いれば、 髙感度に、 微量の 5 —メチルシチジ ンの検出が可能であることが判明した。
    [0068] 実施例 3
    [0069] 実施例 2の 5—メチルシチジン溶液に代えて試料として健 常人及び癌患者の尿を用い同様に競合阻害試験を行なった。 実施例 2の結果から得た検量線を用い、 試料中の 5—メチル シチジンを測定した。 この結果を第 2表に示す。
    [0070] 第 2 表
    [0071] CT-3 を用いた健常人及び癌患者尿中 5 —メ チルシチジンの定量
    [0072] 実施例 4
    [0073] 下の手順にて、 抗修飾核酸塩基類モノ ク口ーナル抗体を 用いて食道癌組織の免疫組織染色を行なった。
    [0074] ① 食道癌組織 （手術摘出標本） は、 ホルマ リ ン固定した のちにパラ フ ィ ン包埋し、 3 〜 5 ju m の切片を作製する。 ② 切片をス ライ ドグラス上にうつしとつたのち、 正常ゥ マ血清で処理して、 非特異的吸着を防ぐ。
    [0075] ③ 次に、 モノ ク ロ ーナル抗体 （抗 1一メ チルアデノ シン 抗体、 抗シユ ー ドウ リ ジン抗体， 5 g/ m£の濃度） で処理し 室温で 1時間反応させる。
    [0076] ④ ス ラ イ ドグラスを緩衝液で、 よく洗浄したのち、 ビォ チ ン化抗マウス I g Gで処理し、 室温 3 0分間反応させる。 ⑤ スライ ドグラスを緩衝液でよく洗'净したのちに西洋ヮ サビペルォキシダーゼ一了ビジン複合体で処理し、 室温 3 0 分間反応させる。
    [0077] ⑥ スライ ドグラスを緩衝液でよく洗浄したのちに、 基質 液 （0. 5 mg Z n^ジ了 ミ ノ ベンチジン、 0. 0 1 %過酸化水素永 を含むリ ン酸緩衝液） を加えて発色させる。
    [0078] ⑦ 核は、 へマ トキシリ ン波により染色する。
    [0079] その結果を第 3〜 5図に示す。 その結果、 抗 1 ーメチルァ デノ シンモノ クローナル抗体及び抗シユー ドウ リ ジンモノ ク πーナル抗体のいずれを用いた場合も正常組織は染色されず, 癌組織が特異的に染色された。 なお、 第 3図及び第 4図にお いて濃灰色〜黒色の部分が染色部位 （反応腸性部位） である { 産業上の利用可能性
    [0080] 本発明のモノ ク口ーナル抗体は、 低級アルキルシチジン、 殊に 5 —メチルシチジンを髙感度に認識する優れた特性を有 するものである。 また本発明のハイプリ ドーマは、 かかる優 れた特性を有するモノ クローナル抗体を産生する有用な性質 をもつものである。 また本発明の測定法、 試薬キッ トによれ ば、 体液等の被検体の前処理を行うことなく低級アルキルシ チジンの測定を容易に行うことが可能であって、 多数の被検 体に対して簡便かつ迅速に進行癌の有無を判定することがで きる。
    [0081] さ らに本発明の検索法によれば、 腫瘍組織において異常代 謝亢進の結果蓄積された修飾核酸塩基類の検出を容易に行う ことができる。 また本発明のイ メージング診断用のモノ ク ロ ーナル抗体は、 体内で進行中の癌の診断を極めて容易に行う ことを可能にするものであり、 薬剤ミサイ ルは、 抗痛剤等を 患部に有効に投与して髙ぃ治療効果を実現するものである。
    权利要求:
    Claims請 求 の 範 囲
    1. 低級アルキルシチジンを認識し得るモノ ク ϋ一ナル抗 体。
    2. 該低級アルキルシチジンが 5 —低級了ルキルシチジン である請求項 1のモノ クひーナル抗体。
    3. 該低級アルキルシチジンが 5 —メチルシチジンである 請求項 1のモノ クロ ーナル抗体。
    4. 該低級アルキルシチジンが生体試料中のものである請 求項 1 のモノ ク ローナル抗体。
    5. 低級アルキルシチジンとキャ リ ア ' プロテイ ン一 I と の結合物を免疫原として用いて得られた脾細胞と、 ミ エロ ー マ細胞とを融合して得られるハイ ブリ ドーマが産生する請求 項 1のモノ ク ーナル抗体。
    6. 該脾細胞がマウス脾細胞であり、 該ミエ π—マ細胞が マウス由来ミ エ 13—マ細胞である請求項 5 のモノ ク ローナル 体。
    7. 抗体のクラスが I gG である請求項 1のモノ ク ローナル 体。
    8. 該 I gG が I gG！である請求項 7のモノ クローナル抗体。
    9. 放射性物質、 常磁性物質及び螢光物質の群から選ばれ る少なく とも一種で標識化された請求項 1 のイメージング診 断用のモノ ク口ーナル抗体。
    1 0. 低級アルキルシチジンとキヤ リ 了 ' プ σティ ン一 I との結合物を免疫原として用いて勤物を免疫して得られた低 級アルキルシチジンを認識し得る抗体の産生能を有する脾細 胞と、 ミ エローマ細胞とを融合して得られるハイ プリ ドーマ c 1 1. 免疫学的方法による被検体中の低級アルキルシチジ ンを測定する方法において、 低級アルキルシチジンを認識し 得るモノ クロ ーナル抗体を用いることを特徴とする測定法。
    1 2. 免疫学的方法により被検体中の低級アルキルシチジ ンを測定するための試薬キッ トであって、 低級アルキルシチ ジンを認識し得るモノ ク ローナル抗体と、 低級アルキルシチ ジンとキヤ リ 了 · プロティ ンー Π との結合物を用いたことを 特徴とする試薬キッ ト。
    1 3. 腫瘍組織中において異常代謝亢進の結果蓄積された 修飾核酸塩基類の存在を免疫組織化学的に検索する方法にお いて、 該修飾核酸塩基類を認識し得るモノ ク ーナル抗体を 免疫反応により組織の一部に結合せしめることを特徵とする 検 法。
    1 4. 該修飾核酸塩基類が低級了ルキルシチジンである請 求項 1 3の検索法。
    1 5. 該修飾核酸塩基類がシュ一ドウ り ジンである請求項 1 3の検索法。
    1 6. 該修飾核酸塩基類が 1 一メチルアデノ シンである請 求項 1 3の検索法。
    1 7. 腫瘍組織中において異常代謝亢進の結果蓄積された 修飾核酸塩基類を認識し得るモノ ク —ナル抗体を抗癌剤又 は制癌剤のキヤ リ ア一として用いたことを特徵とする薬剤ミ サイル。
    1 8. 該修飾核酸塩基類が低級了ルキルシチジンである請 求項 1 7の薬剤ミサイル。
    1 9. 該修飾核酸塩基類がシユ ー ドウ リ ジンである請求項 1 7の薬剤ミサイル。
    2 0. 該修飾核酸塩基類が 1一メチルアデノ シンである請 求項 1 Ίの薬剤ミサイル。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    AU5178090A|1990-10-09|
    EP0433452A1|1991-06-26|
    EP0433452A4|1991-12-04|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1990-09-20| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU CA JP US |
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    1990-11-06| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1990904427 Country of ref document: EP |
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    2000-01-01| ENP| Entry into the national phase in:|Ref country code: CA Ref document number: 2028849 Kind code of ref document: A Format of ref document f/p: F |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP1/55018||1989-03-09||
    JP5501889||1989-03-09||JP50426890A| JP2896931B2|1989-03-09|1990-03-08|モノクローナル抗体、それを用いた測定法、試薬キット、検索法及び薬剤ミサイル|
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